satır arası

1984 yılında Kary Mullis isimli bir bilim insanı tarafından icat edilen polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi, bilim dünyasında devrim niteliğindeki gelişmelerden biri olarak kabul edilir. PCR ve benzeri gelişmeler sayesinde gen çeşitliliği ve genlerin kendi arasındaki etkileşimi hakkında birçok bilgi elde edilmiştir. PCR tekniğinin en çok kullanıldığı alanların başında mikrobiyoloji laboratuvarları gelir. Bu laboratuvarlarda pcr yöntemi sayesinde insanlarda çeşitli hastalıklara neden olan birçok mikrobun tespit edilmesi gerçekleştirilebilir.

PCR (Polymerase Chain Reaction- Polimeraz Zincir Reaksiyonu) testi bugünlerde corona virüs salgını nedeniyle sık sık gündeme gelen bir testtir. Corona virüs teşhisi için kullanılan bu testin başta sağlık alanı olmak üzere birçok kullanım alanı bulunur. Bu yazıda PCR testinin tam olarak ne olduğu, hangi amaçlarla kullanıldığı, PCR testinin uygulanma şekli ve uygulanırken dikkat edilmesi gerekenler, corona virüste nasıl kullanıldığı gibi başlıklar ayrıntılı olarak incelenmiştir.

PCR testi nedir?

PCR (Polymerase Chain Reaction- Polimeraz Zincir Reaksiyonu) DNA içindeki özgün bir bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan tepkimelere verilen genel bir isimdir. PCR yöntemi kısaca DNA replikasyonunun belirli sayıda sürekli taklit edilmesi ya da tekrar edilmesi olarak ifade edilebilir.

Bu yöntem ayrıca "in vitro" yani cansız ortamdaki nükleik asit dizisi klonlama işlemi olarak da tanımlanabilir. PCR testi bir moleküler tanıma tekniğidir. Çok az sayıdaki mikrobu dahi ayırt edebilme yeteneği olan bu test, moleküler tanı tetkikleri arasında ilerlemiş ve duyarlılığı fazla olan bir tekniktir.

PCR testi nasıl yapılır?

PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) tekniği DNA'nın iki zincirinin yüksek ısıya maruz bırakılarak ayrılmasına yani tek sarmal haline gelmesine, sonrasında sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA'ya bağlanarak zincirin uzamasını sağlamasına ve bu döngünün belirli bir sayıda tekrarlanmasına dayanır. Bu özelliği sayesinde PCR testi ile az sayıdaki mikropları bile çoğaltarak tespit etmek mümkün hale gelir.

PCR testinin kullanım alanları nelerdir?

Tanısal amaçla nükleik asit kopyalama tekniklerinin bulunması medikal bilim dallarında önemli bir gelişme olarak kabul edilir. Bu teknolojideki ilerleme ile birlikte klinik kullanımda standart haline gelme yolunda ilerleyen PCR testi, kişiselleştirilmiş ilaç tedavisi planlamalarında hastanın bu ilaçla ilişkili genlerinin tespit edilmesini sağlayarak tedavi sırasında ortaya çıkabilecek önemli ilaç yan etkilerine karşı korunmayı da sağlayabilir.

Hücrenin normal yaşam döngüsü bozulup sürekli olarak bölünme eğiliminde kötü huylu bir karakter elde etmesi kanser ile sonuçlanabilir. Sürekli olarak bölünen kanser hücrelerinde hücre döngüsü, dna tamiri ve büyüme sinyali ile ilgili genlerde oluşmuş farklılıklar PCR yöntemi ile tespit edilebilir. Şu an için tüm kanser türleri için tanısal yaklaşımda sınırlı bir uygulama alanı olan PCR testi, mesane kanseri, meme kanseri, kolorektal kanser ve endometrial kanser gibi bazı kanser türlerinde tanıya katkı sağlayabilir.

PCR yöntemi, insan vücuduna ait örneklerde yer alan virüslerin tespiti konusunda da etkili bir testtir. Bakterilere bağlı oluşan hastalıklarda ise özellikle kültürde üremesi geç olan bakterilere bağlı oluştuğu düşünülen rahatsızlıklarda bu hastalıkların erken dönemlerinde tanı almasına katkı sağlayabilir.

İnsanlarda oluşan bulaşıcı hastalıklarda olduğu gibi hayvan hastalıklarında da tanısal fayda sağlayabilen PCR testine veterinerliğe dair teşhis ve tedavi planlamasında da başvurulur.

PCR testi, temeli tanı olan birçok araştırmada, çalışmada, bilinmeyen özelliklerin tayininde kullanılır. PCR testinin sağlık alanındaki birçok kullanım alanı şu şekilde özetlenebilir.

  • Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısı

PCR testinde gen dizilerinin çoğaltılması ile bu genlerdeki bozukluklar tespit edilebilir. Taşıyıcılarda dahi erken teşhis konulabilmesi bu testin büyük bir avantajıdır.

  • Prenatal tanı

Doğum öncesinde fetüsteki anormallikler bu yolla tespit edilebilir. Bu anormallikler genellikle genetik hastalık kaynaklıdır.

  • Klinik örneklerde patojen organizmaların saptanması

Az sayıdaki mikrobu dahi çoğaltarak patojen organizmaların ayırt edilmesinde büyük katkısı vardır. Hastalık teşhisinde hızlı ve duyarlı bir tekniktir. Corona virüs tespitinde de patojen organizma bu yolla tanınabilir ve teşhis konulur.

  • Adli tıp

Bu yöntemde PCR testinde gerçekleştirilen gen dizileri çoğaltılması ile suçlu kişilere ait DNA analizi yapılabilir. Bu nedenle adli tıpta büyük bir öneme sahiptir.

  • Kanser ile alakalı araştırmalar

Tümör oluşan genlerdeki mutasyonlar PCR testi sayesinde tespit edilebilir.

  • Babalık testi
  • Probe'ların oluşturulmasında/ klonlamada/ gen ekspresyon araştırmaları
  • DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulması
  • Bilinmeyen gen dizilerinin tayini
  • Geçmiş DNA'nın incelenmesi ve biyolojik evrimin aydınlatılması
  • Biyoteknoloji alanında aşıların geliştirilmesi
  • In vitro fertilizasyon yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik testlerin yapılması ve sonra implantasyon gerçekleştirilmesi ile bebeğin normal doğmasının sağlanması
  • PCR kaynaklı RAPD, AFLP, SSR ve ISRR gibi birçok bitki ve hayvanda genetik akrabalığın teşhisinde kullanılan teknikler geliştirilmesi
  • DNA protein interaksiyonunun araştırılması (footprinting)

PCR testi yukarıda sayılan sağlık alanındaki kullanımları dışında gıda ve tarım gibi sektörlerde de birçok kullanım alanına sahip bir tetkiktir.

Gıda güvenliği, sağlığı önemli şekilde etkileyen faktörlerden biridir ve kontamine veya virüslerle enfekte besinlerin tüketilmesi sonucu ciddi hastalıklar meydana gelebilir. PCR yöntemi gıda sağlığı ile ilişkili hastalık etkeni olabilecek bu faktörlerin tespit edilmesinde de kullanılabilir.

PCR testi hangi hastalıklarda kullanılabilir?

PCR testi, mikrobiyal etkenler ile meydana gelen rahatsızlıkların tanısında önemli kullanım alanı olan bir tetkiktir. Çeşitli bakteriyel, viral, paraziter ya da mantarlara (fungal) bağlı olarak meydana gelen rahatsızlıkların tanısında PCR testi fayda sağlayabilir:

  • Bakteriyel Hastalıkların Teşhisinde PCR Testi Kullanımı

PCR testi, bakteriyel patojenlerin tespitine ek olarak bu canlılarda kullanılan antibiyotiğe karşı oluşturulmuş direnç genlerinin saptanmasında da fayda sağlayabilir. Örnek olarak streptococcus bakterisine bağlı olarak meydana gelen boğaz enfeksiyonlarda boğazdan sürüntü örneği alınarak ya da antibiyotik kullanımı sonrasında ishallere neden olabilen clostridium difficile ve bağırsak enfeksiyonlarına neden olabilen e.coli bakterisi için feçesten alınan örneklerin PCR ile incelenmesi sonucunda kültürde üretmeye nazaran daha kısa sürede sonuç alınabilir.

Bu bakteriler dışında atipik (normalden farklı) seyirli zatürre (pnömoni) etkeni olan mikoplazma, klamidya ve lejyonella gibi bakterilere bağlı meydana gelen akciğer enfeksiyonların tanısında da PCR testi kullanılabilir. Atipik zatürre etkenleri ile meydana gelen enfeksiyonlarda hastalığa neden olan bakterilerin kültür sonuçları oldukça zaman alıcıdır. Bu hastalardan alınan boğaz sürüntü örneklerinde PCR testi yapılması ile bu bakteriler daha kısa sürede tespit edilebilir.

  • Viral Hastalıkların Teşhisinde PCR Testi Kullanımı

PCR testinin ilk kullanım alanlarından biri viral hastalıkların teşhis edilmesidir. Uçuk olarak bilinen lezyonların gelişmesine neden olan herpes simpleks virüsü (HSV) genital bölge, cilt ve santral sinir sistemini kapsayan klinik belirtilere neden olur. Bu hastalığın beyin yapılarını etkilemesi ve hastanın uygun tedavi almaması halinde hastalığın ölümcül seyretme ihtimali %70’e kadar yükselebilir. Bu virüsün DNA’sında yer alan bazı genlerin PCR testi ile araştırılması sayesinde kişide bu virüsün varlığı klinik belirtilerin başlamasının 1 gün ardından tespit edilebilir.

Bu virüs dışında PCR testi ile, su çiçeği etkeni olan varicella zoster virüsü, lenfoma gelişimini tetikleyebilen Epstein-Barr virüsü, böbrek ve beyinde önemli derecede hasara neden olabilen JC ve BK virüsleri, çocuklarda 5.hastalık olarak bilinen rahatsızlığa neden olan parvovirüs b19 ve influenza, adenovirüs ve coronavirüs gibi solunum yolu rahatsızlık etkenlerinin de tespit edilmesi gerçekleştirilebilir.

Covid-19 teşhisinde PCR testinin rolü nedir?

Kısa süre içerisinde tüm dünyayı etkisi altına alan yeni tip coronavirus (SARS-CoV-2) kaynaklı COVID-19 hastalığında salgının kontrolü ve önleme çalışmaları için PCR testi oldukça önem arz eden bir tetkiktir. Gerçek zamanlı RT-PCR testi özellikle erken dönemdeki hastalığın tanısında oldukça yardımcıdır. Bu test ile ilgili oluşan şüphenin temelinde yalancı pozitif veya yalancı negatif sonuçlanma riski yer alır.

Covid-19 teşhisine yönelik olarak gerçekleştirilen PCR testlerinin çoğunluğunun sonuçlarında herhangi bir problem meydana gelmez. Çok erken zamanda gerçekleştirilen testlerde hastada henüz tespit edilebilecek düzeyde viral yük oluşmadığı için bu tetkik yalancı negatif olarak sonuçlanabilir. Bu nedenle PCR testinin doğru sonuç verebilmesi için örnekler doğru şekilde ve doğru zamanda alınmalıdır.

Coronavirus tanı testleri moleküler ve serolojik testler olarak iki tiptir. Covid-19 teşhisinde kullanılan testler virüsün genetik materyalini (DNA veya RNA olabilir) veya antijenik materyalin bağışıklık sistemini harekete geçirmesi ile savunma hücrelerinin virüse karşı oluşturduğu antikorların tespiti yardımıyla yapılabilir. Virüsün genetik materyalini tespit etmeye yarayan testlere moleküler testler denilirken virüsün antijen- antikorunu tespit etmeye çalışan testlere serolojik testler denir.

Antikor-antijen testleri yani serolojik testler, daha önce geçirilmiş olan veya o anda geçirilmekte olan viral enfeksiyonun aşamalarını tespit edebilmek için kullanılan tetkiklerdir. Corona virüste serolojik testlerin doğrulanması için ise gerçek zamanlı PCR testi kullanılabilir. Kullanılacak olan testler hastalığın evresine göre değişkenlik gösterebilir.

Coronavirus salgınına dair önleme ve kontrol çalışmalarının önemli bir parçası olan PCR testi, kolaylık ve spesifikliği sayesinde bu hastalıkta erken tanı imkanı sağlayabilir. Covid-19 teşhisinde pcr testi kullanımındaki problemlerin başında yalancı negatiflik veya yalancı pozitiflik saptanabilmesi gelir. Bu nedenle klinik olarak covid-19 tanısının konulmasında pcr testi ile hastanın belirti ve bulgularının uyumlu olması göz önünde bulundurulabilir.

PCR testinin corona virüs teşhisinde kullandığı esas virüste RNA'ya bağlı olarak bulunabilen RNA polimeraz enzim genini yani genetik materyalini tespit etmesidir. Bu test mutlaka bilgili bir mikrobiyolog, laborant tarafından uygulanmalıdır. Aksi takdirde çok yanlış sonuçlara yol açabilir. Yanlış sonuçlar neticesinde hastalığın teşhis edilememesi söz konusu olabilir. Bu durum da virüsün daha fazla yayılmasına olanak sağlayabilir.

Sonuçların negatif gelmesi durumunda testin yanlış uygulanmış olma olasılığının göz önünde bulundurulması gerekir. Testin doğru sonuç verebilmesi için örneğin alındığı zaman ve örneğin doğru alınıp alınmadığı da çok önemlidir. PCR testinin performansı RNA tespitinden teşhis yaptığı için alınan örnekte bulunan RNA bolluğuna göre değişir. Bu yüzden alınan örneğin kalitesi de bu testin verimliliği için çok önemlidir. Ayrıca alınan örneğin uygun olmayan şekilde transferinin yapılması da sonuçlarda yanlışlık doğurabilir.

Virüs mutasyonu veya PCR test inhibisyonu gibi testi yapan kişiden kaynaklı olmayan teknik hatalar da testin uygulanması sırasında oluşabilecek diğer hatalar arasındadır.

Bu zamanda PCR için iki tip uygulama bulunmaktadır. Bu tipler gerçek zamanlı sonuç veren ve hızlı sonuç veren PCR testleridir. Gerçek zamanlı PCR testinde sonuç alınması 3-4 saati bulurken hızlı sonuç veren PCR testlerinde bu süre 1,5 saate kadar inebilir. Türkiye'de bu tiplerden gerçek zamanlı PCR testi kullanılır.

Coronavirüs teşhisi için uygulanan PCR testinde hastadan nazofarengeal sürüntü (burun ve boğazdan sürüntü alınması) veya alt solunum yoluna ait balgam örneği gibi solunum yoluna ait bir organdan örnek alınması gerekir. Bu örnek alınmasında farklı yöntemler kullanılabilir. Bu yöntemler içinde olan boğaz çubuklarıyla örnek alınması ilk hafta için doğru sonuç verebilecek bir yöntemdir.

Hastalığın devamında yani hasta pnömonili hale geldiğinde virüs akciğerlerde hızla yayılırken boğazda sayısı azalarak kaybolabilir ve bu nedenle boğazdan alınan örneğin teşhis için bir anlamı kalmayabilir. Bu yüzden hastalığın ilk haftasından sonra hastalık ilerlediği için öksürük materyali olan balgam üzerinden teşhis yapılabilir.

Örnekler doğru zamanlarda ve doğru şekillerde alındıktan sonra, alınan örnekler virüs RNA’sının çözeltiye geçişini sağlayabilecek bir sıvı viral taşıma besiyerine konulur. Ardından, örnekten çözeltiye geçen RNA'lar bu çözeltiden ayrıştırılır ve sonrasında bu RNA teşhisin kolaylaşması için çoğaltılır. Çoğaltılan RNA üzerinden hangi virüs tipine ait RNA olduğu laboratuvarda yapılan bir takım testlerle belirlenir ve böylece teşhis konulur.

PCR; 94 °C-98 °C aralığında gerçekleştirilen denatürasyon yani yüksek ısıya maruz kalan DNA'nın iki zincirinin ayrılması, 37 °C-65 °C aralığında gerçekleştirilen tavlama yani sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA'ya bağlanması (hibridizasyon) ve 72 °C'de gerçekleştirilen uzama aşamaları olmak üzere 3 aşamadan meydana gelir ve bu aşamaların belirli döngüde, belirli sayıda tekrarlanması ile gerçekleştirilir.

Direkt sonuç veren corona virüs testleri yanında PCR testinin dezavantajı daha geç sürede sonuç vermesidir fakat PCR yönteminin az sayıdaki patojenleri bile tespit etmesi bu yöntemin diğer yöntemlerden daha duyarlı olduğunu gösterir. Bu testin daha duyarlı olması da diğer testlere göre bu testin avantajları arasında sayılabilir. PCR tekniği bazı görüntüleme tetkikleri sonucu olan radyoaktivite maruziyetini azalttığı için de çok avantajlı olan bir yöntemdir.

Radyoaktif teşhis yöntemleri genel olarak vücuda olan zararları ile bilinmektedir bu özelliğinden dolayı teşhis yöntemleri arasında PCR tekniğinin daha ön plana çıkmasına, daha kullanılabilir olmasına yol açmıştır.

Covid-19 hastalığında tıbbi müdahalenin gerekli olduğuna işaret eden belirtiler nelerdir?

Bazı kişilerde hafif ve orta düzeyde solunum yolu enfeksiyonu belirtileri ile seyreden covid-19 hastalığı bazı kişilerde giderek kötüleşen nefes darlığına sebep olabilir. Bir diğer hasta grubunda ise kişilerin oksijen değerlerinde normal nefes alıp verebilmelerine rağmen bir düşüklük meydana gelir. Sessiz hipoksi olarak adlandırılan bu durum ve nefes darlığı gibi belirtiler akut respiratuar distres sendromu (ARDS) olarak bilinen acil müdahale gerektiren bir sağlık problemine doğru ilerleyebildikleri için dikkatli olunmalıdır.

Ani başlangıçlı nefes darlığına ek olarak ARDS gelişen kişilerde beklenmedik şekilde oluşan sersemlik, kalp atışlarının hızlanması ve terleme artışı gibi diğer belirtiler eşlik edebilir. Covid-19 hastalarında rahatsızlığın ARDS’ye ilerleyebileceğine işaret eden çeşitli belirti ve bulgular mevcuttur:

  • Nefes almada zorlanma veya nefes darlığı
  • Göğüste veya gövdenin üst kısmında hissedilen ve gerileme eğiliminde olmayan sıkıştırır tarzda ağrı veya rahatsızlık hissi
  • Ani başlayan akıl karışıklığı
  • Özellikle tırnak yatağı, diş eti, göz çevresi ve dudaklarda belirgin olan mavi-mor renk değişikliği
  • Yapılan çeşitli müdahalelere rağmen düşmeyen ateş
  • El ve ayakların soğuk olması
  • Nabzın zayıflaması

Doğru zamanda ve doğru yöntemlerle profesyonel laboratuvar ortamında uygulanan coronavirus tanı testleri, salgını kontrol altına alma sürecinin önemli bir parçasıdır. Bu nedenle benzer belirtileri olduğunu düşünen hastaların uygun tedaviye ulaşabilmeleri için en yakın sağlık merkezine başvurmaları önerilir.

satır arası

187161

Sayfa içeriği sadece bilgilendirme amaçlıdır. Sayfa içeriğinde tedavi edici sağlık hizmetine yönelik bilgiler içeren ögelere yer verilmemiştir. Tanı ve tedavi için mutlaka hekiminize başvurunuz.